非洲豬瘟試劑盒使用說明書

非洲豬瘟試劑盒又稱非洲豬瘟核酸病毒熒光PCR試劑盒，非洲豬瘟試劑盒利用實時熒光定量PCR原(yuan)理，可用于檢測豬血液、淋巴(ba)結、脾臟、扁桃體等樣本中非洲豬瘟病毒的檢測。

（快提核(he)酸擴增試劑盒）

【產品名稱】

通用(yong)名稱：非洲豬瘟試(shi)劑盒（PCR熒光(guang)探(tan)針(zhen)法） 英文名稱：Diagnostic Kit for African Swine Fever Virus （PCR Fluorescence Probing）

［預期用途］

本試劑盒主要用(yong)于(yu)(yu)檢測(ce)疑似感染豬抗凝血(xue)及臨床(chuang)病(bing)(bing)料(liao)中的非(fei)洲豬瘟(wen)病(bing)(bing)毒（ASFV,African Swine Fever Virus）核酸，適用(yong)于(yu)(yu)非(fei)洲豬瘟(wen)病(bing)(bing)毒的檢測(ce)、輔(fu)助診斷(duan)和流行病(bing)(bing)學調查(cha)。

【試劑盒組分】

1、試劑盒組成及貯藏條件(jian)

2、需自備材料：生理鹽水(shui)、無菌槍頭、熒光PCR專用反應管、記號(hao)筆等。

【操作步驟】一、樣品制備

1、血液樣(yang)品：采集抗凝(ning)血（抗凝(ning)劑為EDTA）或血清樣(yang)品，編號備(bei)用。

2、組織樣品：采集脾臟、肝臟、淋巴結(jie)、扁桃體等(deng)病(bing)變組織樣品或軟蜱0.1g（黃豆粒(li)大小(xiao)），眼科剪(jian)剪(jian)碎(sui)于組織勻漿(jiang)器或研缽(bo)中充分勻漿(jiang)或研磨，再加(jia)1mL生理(li)鹽水(shui)混勻，4°C條件下8000rpm/分鐘(zhong)離心(xin)2分鐘(zhong)，取(qu)上清液于滅菌(jun)離心(xin)管中，編號(hao)備用。

二、DNA提取

取反應(ying)液A 20μL分(fen)別加入(ru)到新(xin)的(de)1.5mL離心管，加入(ru)抗凝而或血(xue)清或組織(zhi)上清液2μL混勻(yun)，室溫（20°C左右）靜(jing)置(zhi)3分(fen)鐘(zhong)，加入(ru)反應(ying)液B 20μL,吹打(da)混勻(yun)即(ji)可，若(ruo)為抗凝全血(xue)，則需8000rpm/分(fen)鐘(zhong)再離心2分(fen)鐘(zhong)后做為待檢DNA溶液。

二、PCR擴增

1、配液(ye)：取(qu)出PCR反(fan)應(ying)液(ye)、酶混合液(ye)，在室溫完全(quan)融化后(hou)，充分(fen)混勻(yun)，瞬離(li)(li)，可將酶混合液(ye)全(quan)部取(qu)岀直接加入到PCR反(fan)應(ying)液(ye)中，充分(fen)混勻(yun)，瞬離(li)(li)后(hou)按(an)每(mei)份20μL分(fen)裝(zhuang)使用(yong)；或按(an)照每(mei)份PCR反(fan)應(ying)液(ye)17μL,酶混合液(ye)3μL的(de)比例取(qu)一定的(de)試(shi)驗用(yong)量，混合兩種反(fan)應(ying)液(ye),瞬離(li)(li)后(hou)按(an)照每(mei)份20μL分(fen)裝(zhuang)到專用(yong)熒光PCR 反(fan)應(ying)管中，剩余試(shi)劑立即凍存；（操(cao)作(zuo)過程(cheng)要注意避光）

2、加樣(yang)擴增：分別向上述PCR反應管中加入5μL樣(yang)本 DNA或(huo)陰性(xing)對照(zhao)或(huo)陽性(xing)對照(zhao)，混勻并瞬離,放入熒(ying)光(guang)PCR儀(yi)上運行以下程序：

步(bu)驟(zou) 條件(jian) 循環(huan)數 UNG處(chu)理 50°C：2分鐘1 預(yu)變性 95°C：3分鐘1 預(yu)擴(kuo)増 95°C：8秒(miao)55C：8秒(miao)5 PCR擴(kuo)增 95°C：8秒(miao)55°C：8秒(miao)40

熒光(guang)通道選擇(ze)FAM,在40循(xun)環階段(duan)每個循(xun)壞的55°C時(shi)收集(ji)熒光(guang)信(xin)號(hao)。設置擴增體系為25μL,同時(shi)要選擇(ze) passive reference 和 quencher 為 none 的模式。

(注(zhu):若熒光PCR儀(如ABI7500)按說明(ming)書中的反應(ying)程序設置(zhi)后因持溫(wen)時間短無法運行,可將預擴增(zeng)和PCR擴增(zeng)條件變更(geng)為95°C：5秒55°C：30秒。)

【結果(guo)判定】1、基線和閾(yu)值(zhi)設(she)定；基線調整取6-15個循環的熒光信號，閾(yu)值(zhi)設(she)定以閾(yu)值(zhi)線剛好超過陰(yin)性對照檢測熒光曲線的最高點為原(yuan)則。

2、質量控(kong)制：反應(ying)結束后，陰性對(dui)照的檢測(ce)結果應(ying)無特定的擴增(zeng)曲線，Ct值為＞38或(huo)無；陽性對(dui)照 的Ct值應(ying)≤30.0,且明顯(xian)的擴增(zeng)曲線；否則實驗視為無效。

3、樣(yang)品判(pan)定(ding)：待檢樣(yang)品熒光信號有(you)指數型增(zeng)加，且(qie)結果顯示Ct值<35.0,報告為(wei)陽性(xing)；未檢測到(dao)Ct 值或Ct值＞38或無明顯擴(kuo)增(zeng)曲(qu)線，則(ze)樣(yang)品判(pan)定(ding)為(wei)陰(yin)性(xing)。35≤Ct值≤8時，復(fu)檢一次，重復(fu)結果為(wei)陽性(xing)者判(pan)定(ding)為(wei)陽性(xing)，否則(ze)判(pan)定(ding)為(wei)陰(yin)性(xing)。

【注意事項】1、實驗(yan)前(qian)請仔細(xi)閱(yue)讀本試(shi)劑(ji)盒說明書，嚴格按(an)照操作步驟執行，在操作過(guo)程中(zhong)對(dui)時間(jian)、試(shi)劑(ji)體積等(deng)精(jing)確控(kong)制可以獲得最好的結果。

2、實驗(yan)室應嚴格按照有關規定分區(qu)管理。各區(qu)間人(ren)員、器材、試劑及空(kong)氣流向應有產格要求。

3、有(you)關耗材確保潔凈、無菌，核酸提(ti)取完成后盡快進入下(xia)一步(bu)試(shi)驗(yan)或冷凍(dong)保存。

4、預混后的試(shi)劑應盡量在短期內使用(yong)完畢(bi)(bi)，戶外使用(yong)應在加冰袋的泡沫盒保存，每日試(shi)驗(yan)完畢(bi)(bi)應及時冷凍保存。

5、對于熒光PCR管要避(bi)免徒手或使用過的手套接觸，檢(jian)測(ce)過程中使用不帶熒光物(wu)質一次性(xing)乳膠手套。

6、凍(dong)存試劑(ji)使用前(qian)應于室溫下(xia)完(wan)全融化，充分混勻(yun)，瞬時離心使液體完(wan)全沉于管(guan)底。

7、樣品、陰性對(dui)照封蓋后，在通風環境添加(jia)陽(yang)性對(dui)照并及時封蓋，避免(mian)組分(fen)間及氣溶膠等假陽(yang)性污(wu)染(ran)。

8、擴增反應(ying)完畢后(hou)的PCR管嚴禁開蓋,應(ying)和試驗產生的其(qi)它廢(fei)棄物一起(qi)及時收集(ji),遠離PCR實驗室(shi)進行無害化處理。

【規(gui)格】50頭份/盒。

【貯(zhu)藏(zang)與有效(xiao)期】-20°C以下避光保存，有效(xiao)期12個月。

僅供獸醫診斷使用