養殖場專用非洲豬瘟檢測試劑盒（柱膜法(fa)）使用(yong)說(shuo)明(ming)書

養殖場專用非洲豬瘟檢測試劑盒又稱環境檢測非洲豬瘟試劑盒，養殖場專用非洲豬瘟檢測試劑盒以(yi)探針法熒(ying)光定(ding)量PCR技術為基(ji)礎開發的專門(men)檢(jian)測非(fei)洲豬瘟病毒的試劑盒(he)。

【產品(pin)名稱(cheng)(cheng)】通用名稱(cheng)(cheng)：病毒DNA提取試劑(ji)盒(he)

英文名稱(cheng)：Extraction Kit for Virus DNA

【預期用(yong)途(tu)】本試劑盒主要用(yong)于疑似(si)病(bing)(bing)毒等(deng)病(bing)(bing)原感染抗凝血、血淸、拭子(zi)、組(zu)織、飼料及環境中(zhong)的病(bing)(bing)毒DNA的提取，純化的核(he)酸可適用(yong)于各種(zhong)常規操(cao)作(zuo)及PCR試驗(yan)。

【試劑盒組分】

I、試劑盒組成(cheng)及(ji)貯藏條件 名(ming)稱(cheng) 20T 50T

1、吸附柱 20個 50個 2、收集管 20個 50個 3、裂解液(ye) 5mL11mL4、洗液(ye)I13mL32mL5,洗液(ye)II13mL32mL6.洗脫液(ye)1.2mL3mL

2、保存(cun)條件及有效期：室(shi)溫下保存(cun)，有效期12個月.

3、需自備材料：無水乙醇、1.5mL無菌離心管、1.5mL無菌離心管（長臂型(xing)）、生理(li)鹽水、研缽(bo)、無菌1mL,2OOuL、10uL槍頭、記號筆等。

【操作步驟】

一、樣品制備

1、血液樣(yang)品(pin)：抗凝血樣(yang)品(pin)置離心管(guan)(guan)中，8000轉/分(fen)(fen)鐘(zhong)(zhong)離心2分(fen)(fen)鐘(zhong)(zhong)，取(qu)上(shang)層(ceng)血漿；非抗凝血樣(yang)品(pin)置離心管(guan)(guan)中，待凝固后，8000轉/分(fen)(fen)鐘(zhong)(zhong)離心2分(fen)(fen)鐘(zhong)(zhong)，取(qu)上(shang)層(ceng)血清，置于滅菌(jun)離心管(guan)(guan)中，編號待檢(jian)。

2、組(zu)織樣(yang)(yang)品：采集脾臟、肝(gan)臟、淋巴結(jie)、扁桃體等病變組(zu)織樣(yang)(yang)品0.1g.組(zu)織勻(yun)(yun)漿器(qi)或(huo)(huo)研缽中充分(fen)勻(yun)(yun)漿或(huo)(huo)研磨，加入1mL生理鹽水混勻(yun)(yun)，8000轉/分(fen)鐘離(li)心(xin)2分(fen)鐘，取(qu)上(shang)清于滅菌離(li)心(xin)骨中，編號(hao)待(dai)檢(jian)。

3、口(kou)腔(qiang)液：進食前(qian)用拭子/口(kou)腔(qiang)液采集袋或自制棉線綁紗(sha)布團吸(xi)引動物咀(ju)嚼，收(shou)集口(kou)腔(qiang)液大于500uL，8000轉/分鐘(zhong)離心2分鐘(zhong)，取(qu)上清于滅菌(jun)離心管中，編(bian)號待檢。

4、飼料(liao)：取適量(liang)研磨后的(de)飼料(liao)（約0.2g），放(fang)入含1mL生理鹽(yan)水或(huo)PBS（PH為7.4）緩沖液的(de)2mLEP管(guan)屮，振(zhen)蕩混勻，8000轉/分鐘離心2分鐘，取上清于滅菌(jun)離心管(guan)中(zhong),編(bian)號待檢(jian).

5、灰塵：用無菌(jun)棉簽蘸取適量環(huan)境表(biao)面(mian)上的灰塵，放入含1mL生理鹽水或(huo)PBS（PH為7.4）緩沖液(ye)的2mLEP管中，振蕩混勻，8000轉/分鐘離心(xin)2分鐘，取上清于滅菌(jun)離心(xin)管中，編號待檢。

二、DNA的提取

1、取裂解液200uL加(jia)入無核酸(suan)酶1.5mL離(li)心曾屮，分(fen)別加(jia)入血漿/血清/組織液等樣(yang)品(pin)液200uL.震(zhen)蕩混(hun)(hun)勻10秒(miao)或顛倒混(hun)(hun)勻10次，室溫放置5分(fen)鐘(zhong)（如果(guo)室內溫度(du)較低時.需放置25C水浴(yu)溫育），再加(jia)入200uL無水乙(yi)醇，顛倒混(hun)(hun)勻10秒(miao)；若樣(yang)品(pin)渾濁則先12000轉/分(fen)鐘(zhong)離(li)心1分(fen)鐘(zhong)處理，取上清液，以避免(mian)堵(du)塞柱子；

2、將液體轉入套有收(shou)集管的吸附柱中，12000rpm離心1分鐘：

3、棄收集管液(ye)體，向吸附柱中加600uL洗液(ye)I,12000rpm離心1分鐘(zhong);

4、棄收集管液(ye)體，向(xiang)吸附柱中(zhong)加600uL洗液(ye)II，12000rpm離心I分鐘(zhong)；

5、棄收集管液體，12000rpm離(li)心2分鐘，以徹底去除殘留(liu)洗(xi)液；

6、將(jiang)吸附(fu)柱(zhu)轉入(ru)新的無核酸酸1.5mLEP管(guan)（長臂型）中，向柱(zhu)中央滴加50uL洗脫液(ye)，靜置(zhi)1分(fen)鐘(zhong),12000rpm離心1分(fen)鐘(zhong)，EP管(guan)中液(ye)體即(ji)為病毒(du)DNA。

【注意事項】1、實驗前(qian)諾仔細閱讀(du)本試劑盒說明書，嚴格按照操作步驟執行.在操作過程中對時間、試劑體積等粘確控(kong)制可以獲得最好的結果(guo)

2,樣本應新鮮(xian)采集使用(yong)，或(huo)低溫運輸儲存；

3,樣本具有潛在感染風險(xian)，核酸的(de)(de)提取應(ying)在核酸提取實驗室的(de)(de)生物安全柜中(zhong)進(jin)行。

4、核酸提(ti)取(qu)冇關耗材確(que)保高(gao)溫滅(mie)菌，提(ti)取(qu)后核酸盡快進入下一步試驗(yan)或(huo)冷凍保存(cun)待用。

5,試劑(ji)使用(yong)前應混合均勻，試劑(ji)具有一(yi)定腐蝕性，使用(yong)時(shi)請戴手(shou)套、口罩做好防(fang)護。

6.低溫下裂解液出現(xian)結晶數屬正常現(xian)象，可(ke)在60°C水浴加熱(re)助(zhu)溶后使用。

7、實(shi)(shi)驗(yan)產生的廢棄物應及(ji)時收集，遠離PCR實(shi)(shi)驗(yan)室(shi)進行無害化處(chu)理(li)。

僅供獸醫診斷使用

非洲豬瘟病(bing)毒熒光(guang)PCR核酸檢測試劑盒(he)說(shuo)明(ming)書【獸藥名稱(cheng)】

通用名(ming)稱：非洲豬(zhu)瘟(wen)病(bing)毒熒光PCR核(he)酸(suan)檢測(ce)試劑盒(he)

漢語拼音:Feizliouzhuwen Bingdu Yingguang PCR Hesuan Jianceshijihe

英(ying)文名稱：African swine Fever Virus (ASFV) PCR Nucleic Acid Diagnostic Kit

商品名稱：無

【主(zhu)要成分(fen)(fen)與含量(liang)】試劑(ji)盒中含有如(ru)下組(zu)分(fen)(fen):試劑(ji)盒組(zu)分(fen)(fen)含量(liang)，陽性對照(zhao)250μL/管(guan)×1管(guan)，陰性對照(zhao)250μL/管(guan)×1管(guan)，PCR反應(ying)液850μL/管(guan)×1管(guan)，萌(meng)混合液150μL/管(guan)×1管(guan)，說明(ming)書1份/盒

【作用(yong)與用(yong)途】本試劑盒可用(yong)于(yu)血液、脾臟、肝臟、淋(lin)巴結(jie)、樣品中非洲豬瘟病毒(du)核酸(suan)的檢測。扁桃體、腎臟、肌肉(rou)、環境樣品等(deng)

【用法與判定】

1用法

1.1待(dai)檢樣品釆集、保(bao)存及運輸

1.1.1樣品釆集

（1）活豬樣品 無(wu)菌采集抗凝(ning)血或血清5mL

（2）病死豬(zhu)剖檢(jian)(jian)樣(yang)(yang)品或屠(tu)宰場(chang)剖檢(jian)(jian)樣(yang)(yang)品，無(wu)菌采集死豬(zhu)的(de)牌、肺、腎(shen)、扁桃體、淋巴(ba)結、肌肉(rou)等組(zu)織樣(yang)(yang)品。2?8°C低溫運至實(shi)驗(yan)室用(yong)于檢(jian)(jian)測。

（3）病(bing)豬(zhu)(zhu)污染(ran)的(de)周邊環境 采集與病(bing)豬(zhu)(zhu)相(xiang)關(guan)場(chang)所的(de)糞便、飼料、污水樣品(pin)。2?8°C低溫運至實驗室(shi)用于檢測。

1.1.2樣品保存

采集的樣品(pin)在2?8°C保(bao)存應不超(chao)過24小時，-70°C條件下保(bao)存，避免反復凍融。

1.1.3樣品運輸

泡沫箱加冰(bing)袋后密封進行運(yun)(yun)輸(shu)(shu)(shu)。包(bao)裝和運(yun)(yun)輸(shu)(shu)(shu)應符合農業農村(cun)部《高(gao)致(zhi)病性(xing)動物病原微生物菌（毒）種或者(zhe)樣品(pin)運(yun)(yun)輸(shu)(shu)(shu)包(bao)裝規范》和交通運(yun)(yun)輸(shu)(shu)(shu)部門關(guan)于(yu)危險(xian)品(pin)運(yun)(yun)輸(shu)(shu)(shu)管理的有關(guan)規定。

1.2樣品處理

1.2.1血(xue)液樣品(pin)處理

抗(kang)凝(ning)(ning)血樣(yang)品置(zhi)于離心(xin)管(guan)中，8000r/min離心(xin)2分鐘取(qu)上層(ceng)血漿，編(bian)號待檢。非抗(kang)凝(ning)(ning)血樣(yang)品置(zhi)于離心(xin)管(guan)中，待凝(ning)(ning)固后(hou)，8000r/min離心(xin)2分鐘取(qu)200μL上層(ceng)血清，編(bian)號待檢。

1.2.2組織樣品(pin)處理

取適(shi)量脾臟、肝(gan)臟、淋巴結、扁桃體、肌肉等組(zu)織(zhi)(zhi)，置于研(yan)磨(mo)器或(huo)研(yan)磨(mo)管(guan)中(zhong)(zhong)研(yan)磨(mo)，再加適(shi)量生(sheng)理鹽水混勻(yun)，制成約10%的組(zu)織(zhi)(zhi)勻(yun)漿(jiang)，8000r/min離心2分鐘，取200μL上 清于RNase/DNase-free無菌離心管(guan)中(zhong)(zhong)，編號備用。

1.2.3環(huan)境樣品處理(li)

1.2.3.1糞(fen)便(bian)、飼料樣品(pin)處理方法(fa)

取適量(liang)的(de)糞(fen)便、飼料放入盛(sheng)有PBS緩沖液的(de)研(yan)磨(mo)管中(zhong)研(yan)磨(mo)混勻(yun)(yun)，制成(cheng)約10%的(de)勻(yun)(yun)漿液.8000r/min離心2分鐘，取200μL上清于(yu)RNase/DNase-free無菌離心管中(zhong)，編號備(bei)用。

1.2.3.2污(wu)水(shui)樣品(pin)處理方法

直(zhi)接(jie)取200μL污水進行核酸提取。

1.3病毒核(he)酸的提取(qu)用磁珠法(fa)或柱式(shi)法(fa)進(jin)行DNA核(he)酸提取(qu)。

1.4熒光PCR反(fan)應：

1.4.1從(cong)試劑盒中取出熒光PCR反(fan)(fan)應液、酶混(hun)合液，室(shi)溫融化后，2000r/min離心5秒。設被檢樣品(pin)、陽性對照(zhao)和陰(yin)性對照(zhao)總(zong)和為n,則(ze)反(fan)(fan)應體系配制如(ru)下：

試劑體系

PCR 反(fan)應液17× (n+1) μL

酶混合液3× (n+1) μL

1.4.2在(zai)新(xin)的(de)RNase/DNase-fire1.5mL離心管中加入上述(shu)試劑，充分混勻后瞬時(shi)離心。按(an)照20μL/管分裝量將(jiang)試劑分裝至熒光PCR反應管。

1.4.3在上述制備好的熒光PCR反應管中分別加入陰性對照、陽性對照各5μL、處理好的待測核酸各5μL,終體積25μL/管，蓋好熒光PCR反應管蓋，混勻后瞬時離心，轉移到熒光PCR儀器 上。

144將PCR反應管放置在熒光(guang)(guang)PCR儀(yi)樣品槽中(zhong)，在熒光(guang)(guang)PCR儀(yi)上運(yun)行以(yi)下程序：

步(bu)驟 條件 循環數 UNG處(chu)理 50℃,2分鐘1 預(yu)變(bian)性 95℃,3分鐘1 預(yu)擴(kuo)增 95℃：8秒(miao)55℃：8秒(miao)5 PCR擴(kuo)増 95℃：8秒(miao)55℃：8秒(miao)40

熒(ying)光通道選(xuan)擇FAM,在(zai)PCR擴增(zeng)(zeng)階(jie)段每個循環的(de)55℃時采(cai)集熒(ying)光信(xin)號。設(she)置擴增(zeng)(zeng)體(ti)系為(wei)25μL,同時要(yao)選(xuan)擇passive reference和(he)quencher為(wei)none的(de)模式。（注：若熒(ying)光PCR儀（如AB17500）按說明(ming) 書中的(de)反應程序設(she)置后(hou)因(yin)持溫時間(jian)短無(wu)法運行，可將(jiang)預(yu)擴增(zeng)(zeng)和(he)PCR擴增(zeng)(zeng)條件變更(geng)為(wei)95C：5秒55°C：30秒）

2結果判定

2.1試驗有(you)效性判定

陽性對照有(you)典型擴增(zeng)曲線(xian)且Ct值≤30.且陰性對照無(wu)Cl值或無(wu)擴增(zeng)曲線(xian)，線(xian)形為直線(xian)或輕(qing)微斜線(xian)，無(wu)指(zhi)數增(zeng)長期。則判(pan)試驗結(jie)果有(you)效。否則，此次試驗視(shi)為無(wu)效。

2.2樣品判定

2.2.1陽性：樣本檢測結果(guo)Ct值≤35且有明顯指數增長期，判定檢出非洲豬瘟(wen)病(bing)毒核(he)酸。

2.2.2可疑：樣本檢測結果(guo)(guo)Ct值在35?38范(fan)圍(wei)內(nei)。此時應對樣本進行重復(fu)(fu)檢測，如果(guo)(guo)重復(fu)(fu)實(shi)驗結果(guo)(guo)Ct值仍在35?38范(fan)圍(wei)內(nei)，有明(ming)顯指數增長期(qi).則(ze)判定為陽性(xing)，否則(ze)為陰(yin)性(xing)。

2.2.3陰性(xing)：樣本(ben)檢測結(jie)果(guo)Ct值(zhi)＞38或無Ct值(zhi)，判(pan)定未檢出(chu)非洲(zhou)豬(zhu)瘟(wen)病(bing)毒核(he)酸。

【注意事項】（1）實驗前請仔細(xi)閱讀本(ben)試劑(ji)盒說明書，嚴(yan)格按照操作步驟執行，在操作過程(cheng)中對時間、試劑(ji)體積等精確控(kong)制可(ke)以獲得最好(hao)的結果。

（2）實驗室應嚴格(ge)按照(zhao)有關規(gui)定(ding)分區(qu)管(guan)理(li)，依照(zhao)配液區(qu)-模板提取區(qu)-擴增區(qu)-分析區(qu)順序進行基因檢測。各區(qu)間人員、器材、試劑及空氣(qi)流(liu)向應有嚴格(ge)要求。

（3）核酸提(ti)取有關耗村(cun)確保潔凈、無DNase/RNase,提(ti)取過程(cheng)盡(jin)量低溫(wen)、快(kuai)速，完成后進入下一步實驗或凍(dong)保。

（4）對于頂部采(cai)光儀器要帶(dai)新的一次性PE手(shou)套對熒光PCR管(guan)封(feng)蓋(gai)，對于底部采(cai)光儀

器要避免徒(tu)手或使用過的(de)手套接觸熒(ying)光PCR管底，檢測(ce)過程中使用不帶熒(ying)光物(wu)質一(yi)次性(xing)乳膠手套。

（5）凍存試劑(ji)使(shi)用前應于室溫(wen)下完全融化，瞬(shun)時離(li)心使(shi)液體完全沉于管底(di)。避免反復凍融，以免影響試劑(ji)性能(neng)。

（6）樣品、陽(yang)性(xing)對照等(deng)在使用后及時封(feng)蓋(gai)，.避免組(zu)分間及氣(qi)溶膠(jiao)等(deng)的污染造成假陽(yang)性(xing)。

（7）擴增產物禁止(zhi)開蓋，實驗產生的廢棄物應及時(shi)收集，遠離PCR實驗室進行無害化處理。

【規格】50頭(tou)份/盒(he)

【貯藏(zang)與有效期】試劑盒置-20°C以(yi)下避光保存，有效期12個月(yue)。

【批準文號】獸藥生(sheng)字163668871

僅供獸醫診斷使用